БЮЛЛЕТЕНЬ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ БИОЛОГИИ И МЕДИЦИНЫ 12/2013; 156(12):753-756.
НАРУШЕНИЕ ФУНКЦИИ TH1- И TH2-ЛИМФОЦИТОВ И ИЗМЕНЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ЦИТОКИНОВ В КРОВИ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ СРОКАХ ХРОНИЧЕСКОЙ ИНТОКСИКАЦИИ ФОСФОРОРГАНИЧЕСКИМИ СОЕДИНЕНИЯМИ
В экспериментах на неинбредных белых крысах установлено, что после хронического действия фосфорорганических соединений (карбофоса и метафоса; 30 сут, суммарная доза 0,3 DL50) в большей степени снижаются иммунные реакции и ИФН-?, связанные с функцией Th1-лимфоцитов по сравнению с иммунным ответом, обусловленным активацией Th2-клеток действием ИЛ-4. Интоксикация ФОС (30 сут) уменьшает концентрацию в крови ИЛ-2, ИЛ-6 и ИЛ-10. Действие ФОВ в течение 60 сут (суммарная доза 0,6 DL50) в равной степени снижает иммунные реакции, связанные с функцией Th1- и Th2-лимфоцитов; вызывает редукцию концентрации в крови ИФН-?, ИЛ- 4, ИЛ-2, ИЛ-6 и не влияет на содержание в крови ИЛ-10. __________________________________________________________________________
Ключевые слова: фосфорорганические соединения, Тh1-, Th2-лимфоциты, иммунотоксичность, цитокины.
ТНЕ DISTURBANCE OF FUNCTION OF THE TH1-AND TH2-LYMPHOCYTES AND CYTOKINES CHANGES IN BLOOD IN DIFFERENT TIME CHRONIC INTOXICATION OF ORGANOPHOSPHORUS COMPOUNDS
P.F. Zabrodskii, M.S. Gromov, I.H. Yafarova
Saratov Branch of Samara Medical Institute "REAVIZ"
It was established in experiments on noninbred rats, that chronic intoxication of organophosphorus compounds - OFC (malathion and metaphos; 30 days, the total dose of 0,3 LD50) largely reduced immune responses and IFN-?, associated with the function of Th1-lymphocytes compared with immune response caused by the activation of Th2-cell action of IL-4. Intoxication of OFC (30 days) reduces the blood concentration of IL-2, IL-6 and IL-10. The action of OFC within 60 days (total dose 0,6 LD50) equally reduces immune responses associated with the function of Th1-and Th2-lymphocytes, causing a reduction in the blood concentrations of IFN-?, IL-4, IL-2, IL- 6 and has no effect on the blood levels of IL- 10.
Keywords:organophosphoruscompounds,Тh1-,Th2-lymphosytes,immunotoxity, cytokines.
E-mail: pfzabrodsky@gmail.com
Исследование хронического действия фосфорорганических соединений (ФОС) на систему иммунитета является одной из наиболее актуальных проблем токсикологии [1,5,7,8,10]. Это определяется отравлениями ФОЛС связанными с использованием в сельском хозяйстве и быту токсичных химических веществ с антихолинэстеразным эффектом, загрязнением окружающей среды экотоксикантами, относяшимися к ФОС, необходимостью уничтожения боевых отравляющих веществ в соответствии с Конвенцией о запрещении разработки, производства, накопления и применения химического оружия и его уничтожении [1], а также ростом отравлений ФОС, формирующих вторичные постинтоксикационные иммунодефицитные состояния [1,9,10,11],
Целью исследования являлась оценка хронического действия ФОC в течение 30 и 60 сут на иммунные реакции, связанные с функцией Тh1- и Th2-лимфоцитов, а также на содержание в крови цитокинов (?- интерферона - ИФН-?, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6 и ИЛ-10).
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
Исследования проводили на беспородных белых крысах обоего пола массой 180-240 г. В качестве ФОС использовали карбофос и метафос, которые вводили подкожно в дозе, составляющей 0,01 DL50, ежедневно в течение 30 и 60 сут. DL50 карбофоса и метафоса составляли при подкожном введении крысам соответственно 815,4+28,0 и 25,3+2,6 мг/кг. Раствор химических веществ в воде для инъекций вводили из расчета 0,5 мл на 200 г массы животного. Крысы контрольной группы получали подкожно равный объем воды.
Показатели системы иммунитета оценивали общепринятыми методами в экспериментальной иммунотоксикологии и иммунологии [1,2] после хронической интоксикации ФОВ через 30 и 60 сут после первой инъекции антихолинэстеразных веществ. Гуморальную иммунную реакцию к тимусзависимому антигену (эритроцитам барана - ЭБ), характеризующую способность Th1-лимфоцитов участвовать в продукции плазматическими клетками IgM, определяли по числу антителообразующих клеток (АОК) в селезенке через 4 сут после иммунизации (пик продукции IgM), которую проводили внутрибрюшинно в дозе 2·108 на 26 и 56 сут после первого введения ФОС. Функцию Th1-лимфоцитов оценивали по реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ). Формирование ГЗТ, исследовали у животных по приросту массы стопы задней лапы в %. Разрешающую дозу ЭБ (5·108) вводили под апоневроз стопы задней лапы через 4 сут после иммунизации, которую проводили внутрибрюшинно на 26 и 56 сут после первого введения ФОС. Реакцию ГЗТ оценивали через 24 ч. Функцию Th2- лимфоцитов исследовали по числу АОК, синтезирующие IgG к ЭБ, в селезенке на пике продукции данного иммуноглобулина (на 14 сут после иммунизации) методом непрямого локального гемолиза в геле [2]. При этом крыс иммунизировали внутрибрюшинно ЭБ в дозе 2·108 клеток на 16 и 48 сут после первого введения ФОС. Содержание кортикостерона в крови определяли после первой инъекции ФОС через 30 и 60 сут общепринятым методом [1]. Концентрацию цитокинов ИФН-?, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6 и ИЛ-10 исследовали в плазме крови крыс через 30 сут после первой инъекции ФОВ методом ферментного иммуносорбентного анализа (ELISA), используя наборы (ELISA Kits) фирмы BioSource Int. При этом ИФН-?, ИЛ-2, ИЛ-6 и ИЛ-10 определяли через 4 сут после иммунизации ЭБ, а ИЛ-4 - на 14 сут. Полученные данные обрабатывали статистически с использованием t-критерия достоверности Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Под влиянием вещества карбофоса и метафоса после хронической интоксикации в течение 30 сут (табл. 1) происходило снижение гуморального иммунного ответа к Т-зависимому антигену (по числу АОК к ЭБ в селезенке), характеризующему функцию Th1-лимфоцитов. При этом синтез IgM, через 4 сут после иммунизации по сравнению с контрольным уровнем уменьшался соответственно в 1,74 и 1,97 раза (p<0,05).
Таблица 1 (В приложении)
После отравления карбофосом и метафосом через 30 сут отмечалась также существенная редукция активности Th1-лимфоцитов, оцениваемая по реакции ГЗТ, соответственно в 1,63 и 1,78 раза (p<0,05). На 14 сут после иммунизации ЭБ отмечалась супрессия продукции IgG (по числу АОК в селезенке), отражающая преимущественно функцию Th2-лимфоцитов, после интоксикации карбофосом и метафосом, соответственно в 1,41 и 1,37 раза (p<0,05).
Параметры, характеризующие клеточную и гуморальную иммунные реакции и связанную с ними функцию Th1- и Th2-лимфоцитов, при действии ФОВ в течение 30 сут в среднем снижались соответственно в 1,70 и 1,37 раза. Это свидетельствует о том, что под влиянием антихолинэстеразных ядов в большей степени поражается функция Th1-лимфоцитов.
После хронического воздействия карбофоса и метафоса в течение 60 сут (табл. 3) отмечалась редукция гуморальной иммунной реакции к Т-зависимому антигену (функция Th1- лимфоцитов). Продукция IgM, через 4 сут после иммунизации по сравнению с контрольным уровнем снижалась соответственно в 2,09 и 2,12 раза (p<0,05).
После интоксикации веществом карбофосом и метафосом через 60 сут отмечалась также существенная редукция активности Th1-лимфоцитов, оцениваемая по реакции ГЗТ, соответственно в 1,37 и 1,46 раза (p<0,05). На 14 сут после иммунизации ЭБ отмечалась супрессия продукции IgG (по числу АОК в селезенке), отражающая преимущественно функцию Th2-лимфоцитов, после интоксикации карбофосом и метафосом, соответственно в 1,60 и 1,85 раза (p<0,05).
Параметры, характеризующие функцию Th1- и Th2-лимфоцитов при действии ФОС в течение 60 сут в среднем снижались соответственно в 1,78 и 1,73 раза. Это свидетельствует о том, что под влиянием антихолинэстеразных ядов в течение 60 сут функция Th1- и Th2- лимфоцитов поражается в равной степени.
Следует отметить, что при оценке влияния ФОС на функцию Th1- и Th2-клеток, мы не принимали во внимание действие токсикантов на В-клетки (плазмоциты) при оценке числа АОК к ЭБ на 5 и 14 сут после иммунизации, так как это практически не повлияло бы на полученные нами данные о сравнительной активности двух типов Th-лимфоцитов.
Полученные данные в отношении большей редукции активности Th1-лимфоцитов по сравнению с Th2-лимфоцитами при интоксикации ФОС через 30 и 60 сут, подтверждается оценкой концентрации цитокинов в крови крыс (табл. 2). После хронической интоксикации карбофосом и метафосом (30 сут) выявлено уменьшение концентрации ИФН-? на 5 сут после иммунизации ЭБ в 1,89 и 1,81 раза (p<0,05), а ИЛ-4 на 14 сут после иммунизации ЭБ - в 1,51 и 1,35 раза (p<0,05) соответственно. Это свидетельствуют о том, что по сравнению с ИЛ-4 концентрация ИФН-? в крови под влиянием ФОС при интоксикации в течение 30 сут снижается в большей степени.
После хронической интоксикации карбофосом и метафосом через 60 сут установлено уменьшение концентрации ИФН-? на 5 сут после иммунизации ЭБ в 2,00 и 2,01 раза (p<0,05), а ИЛ-4 на 14 сут после иммунизации ЭБ - в 1,86 и 2,07 раза (p<0,05) соответственно. Это свидетельствует о том, что концентрации ИФН-? и ИЛ-4 в крови под влиянием ФОС снижаются в равной степени.
Таблица 2 ( В приложении)
Уменьшение соотношения ИФН-?/ИЛ-4 при действии ФОС в течение 30 сут подтверждает большее снижение функциональной активности лимфоцитов Th1-типа по сравнению с функцией Th2-клеток [2,3]. Так, установлено, что при действии карбофоса и метафоса соотношение ИФН-?/ИЛ-4 было существенно ниже контрольного уровня равного в среднем 11,4+0,8 и составляло в среднем 8,7+0,6 (p<0,05). Приблизительно равное соотношения ИФН-?/ИЛ-4 в контроле и при действии ФОС через 60 сут подтверждает одинаковое снижение функциональной активности лимфоцитов Th1-типа и функции Th2-клеток [2,3].
Снижение функции преимущественно Th1-лимфоцитов при действии ФОС в течение 30 сут обусловлено способностью этих соединений активировать гипоталамо- гипофизарно-адреналовую систему, увеличивая в крови концентрацию кортикостерона [1]. При этом известно, что данный гормон в большей степени снижает функцию лимфоцитов Th1-типа по сравнению с Th2-лимфоцитами [2]. Через 60 сут после интоксикации ФОС концентрация кортикостерона существенно снижалась по сравнению с контролем (стадия истощения в реализации общего адаптационного синдрома и снижение способности ФОС активировать гипоталамо-гипофизарно- адреналовую систему) [1]. Так, через 30 и 60 сут концентрация гормона в плазме крови после действия карбофоса составляла соответственно 39,1+3,7 (р<0,05) и 11,5+1,6 нг/мл (р<0,05; контроль - 17,8+1,8 нг/мл; n =7).
Полученные данные позволяют полагать, что относительное уменьшение активности Th1-лимфоцитов по сравнению с функцией Th2-клеток после отравления ФОС через 30 сут может приводить к увеличению вероятности вирусных инфекций (по сравнению с микробными) [4]. При одинаковом снижении двух основных типов Th- лимфоцитов (действие ФОВ в течение 60 сут) равновероятно развитие, как микробной (основная защитная роль выполняется Th2-лимфоцитами и связанными с ними клетками и иммуноглобулинами), так и вирусной инфекции (основная защитная роль наряду с другими Т-клетками и естественными клетками киллерами принадлежит Th1- лимфоцитам) [1,4].
При исследовании концентрации в плазме крови крыс цитокинов ИЛ-2, ИЛ-6 и ИЛ-10 (табл. 3) установлено уменьшение их содержания через 30 сут после хронического действия карбофоса соответственно в 1,39; 1,44 и 1,38 раза (p<0,05), а при действии метафоса - в 1,43; 1,47 и 1,37 раза (p<0,05). Через 60 сут после хронического действия карбофоса концентрация в крови крыс цитокинов ИЛ-2, ИЛ-6 снижалась соответственно в 1,70 и 1,53 раза (p<0,05), а при действии метафоса - в 1,46 и 1,67 раза (p<0,05). Содержание в крови ИЛ-10 практически не снижалась.
Таблица 3. ( В приложении )
Уменьшение в плазме крови под влиянием ФОС ИЛ-2 (провоспалительного цитокина) свидетельствует о супрессии его продукции Т-лимфоцитами (как CD4+, относящимися к лимфоцитам Th0- и Th1-типа), так и некоторыми CD8+, редукции пролиферации Т- и В-клеток (синтеза J-цепи молекулы иммуноглобулина), снижении активности естественных клеток- киллеров. Уменьшение в крови ИЛ-6 (провоспалительного цитокина) характеризует редукцию его синтеза макрофагами и лимфоидными дендритными клетками вследствие их поражения ФОС [1,2].
Концентрация ИЛ-10 (антивоспалительного цитокина), продуцируемого Th0-, Th2- лимфоцитами, моноцитами, макрофагами и В-клетками и снижающего секрецию ИФН-? Th1-лимфоцитами [6] уменьшалась при интоксикации ФОС в течение 30 сут. Снижение синтеза ИЛ-10 в меньшей степени, чем ИФН-?, подтверждает установленный нами больший поражающий эффект ФОС в отношении Th1-лимфоцитов. Относительно небольшая редукция ИЛ-10 через 30 сут и отсутствие ее через 60 сут, вероятно, связано со значительным снижением ФОС синтеза ИФН-?. При этом не реализуется эффект ИЛ- 10, продуцируемого Th0-, Th2-лимфоцитами, моноцитами, макрофагами и В-клетками, который способен усилить супрессию функции Th1-лимфоцитов и синтез ими ИФН-? в еще большей степени [1].
Таким образом, хроническое действие ФОС (30 сут, суммарная доза 0,3 DL50) в большей степени снижает иммунные реакции и ИФН-?, связанные с функцией Th1- лимфоцитов по сравнению с иммунным ответом, обусловленным активацией Th2-клеток действием ИЛ-4. Интоксикация ФОС (30 сут) уменьшает концентрацию в крови ИЛ-2, ИЛ-6 и ИЛ-10. Действие ФОС в течение 60 сут (суммарная доза 0,6 DL50) в равной степени снижает иммунные реакции, связанные с функцией Th1- и Th2-лимфоцитов; вызывает редукцию концентрации в крови ИФН-?, ИЛ-4, ИЛ-2, ИЛ-6 и не влияет на содержание в крови ИЛ-10.
ЛИТЕРАТУРА
1. Забродский П.Ф., Мандыч В.Г. Иммунотоксикология ксенобиотиков. Саратов, СВИБХБ, 2007. 420 с.
2. Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология. Пер. с англ. М.: Мир, 2000. 582 с.
3. Сухих Г.Т., Касабулатов Н.М., Ванько Л.В. и др. // Бюл. эксперим. биол. и мед. 2005. Т. 140, No
12. С. 622-624.
4. Asquith B., Zhang Y., Mosley A.J., de Lara C.M. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-2007. Vol. 104, No 19.
P. 8035-8040.
8
5. Fukuyama T., Tajima Y., Ueda H., Hayashi K. et al. // J. Immunotoxicol. 2011. Vol.8, No2. P. 170-182.
6. Kim H.S., Eom J.H., Cho H.Y. // J. Toxicol. Environ. Health.- 2007.- Vol. 70, No 15-16.- P. 1278-1287.
7. Mahadeshwara P., Gouda H.S., Hallikeri V.R. // Med. Sci. Law. 2010. Vol.50, No 3. P. 159-160.
8. Mercey G., Verdelet T., Saint-Andre G., et al. // Chem. Commun. (Camb). 2011. Vol. 47, No 18. P.
5295-5297.
9. Parikh K., Duysen E.G., Snow B. et al. s // J. Pharmacol. Exp. Ther. 2011. Vol.337, No 1. P. 92-101.
10. Pena-Philippides J.C., Razani-Boroujerdi S., Singh S.P. et al. // Toxicol. Sci. 2007. Vol. 97, No 1. P.
181-188.
11. Tremolada P., Finizio A., Villa S. et al. // Aqat. Toxicol., 2004. Vol. 67, No 1. P. 87-103.
Док. 668097
Опублик.: 06.12.13
Число обращений: 0
Забродский Павел Францевич
|
