Павел Забродский: Роль м- и н-холинорецепторов в реализации холинергического антивоспалительного механизма в ранней фазе сепсисаНазад
Павел Забродский: Роль м- и н-холинорецепторов в реализации холинергического антивоспалительного механизма в ранней фазе сепсиса
БЮЛЛЕТЕНЬ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ БИОЛОГИИ И МЕДИЦИНЫ
2012 г., Том 153, N 5 МАЙ
С. 656-659
РОЛЬ М- И Н-ХОЛИНОРЕЦЕПТОРОВ В РЕАЛИЗАЦИИ ХОЛИНЕРГИЧЕСКОГО АНТИВОСПАЛИТЕЛЬНОГО МЕХАНИЗМА В РАННЕЙ ФАЗЕ СЕПСИСА
П.Ф. Забродский, В.Г. Лим, М.С. Шехтер, А.В. Кузьмин
Саратовский государственный медицинский университет им. В.И. Разумовского
В экспериментах на неинбредных белых мышах установлено, что активация н- и м- холинорецепторов (nAChR, mAChR) соответственно никотином и ацеклидином (эквилетальная доза 0,5 DL50, однократно) за 6 ч до моделирования сепсиса вызывают существенное снижение летальности мышей от экспериментального инфекционного процесса вследствие уменьшения в крови концентрации провоспалительных цитокинов ИЛ-1?, ИЛ-6, MIP-2. Активация mAChR (введение ацеклидина) приводит к повышению фагоцитарно-метаболической активности нейтрофилов. Реализация холинергического антивовоспалительного механизма (возбуждение периферических ?7nAChR и центральных mAChR) модулируется активацией mAChR клеток макрофагально-моноцитарной системы.
________________________________________________________________________
Ключевые слова: холинергический противовоспалительный механизм, сепсис, н-, м-холинорецепторы, макрофагально-моноцитарная система, цитокины
THE ROLE OF M- AND Н-CHOLINORECEPTORS IN REALISATION OF CHOLINERGIC ANTI-INFLAMMATORY PATHWAY (MECHANISM) IN EARLY PHASE OF SEPSIS
P.F.Zabrodskii, V.G.Lim, M.S. Shehter, A.V.Kuzmin
Saratov State Medical University named after V.I. Razumovsky, Russia
It was established in experiments on noninbred mice that activation of nicotinic and muscarinic acetylcholine receptors (nAChR, mAChR) accordingly of nicotine and aceclidine (equilethal dose 0,5 DL50, it is single-pass) at their injection 6 h prior to sepsis modelling invoke essential depression of a lethality of mice from experimental infectious process owing to decrease in a blood of concentration of pro-inflammatory cytokines the IL-1?, IL-6, MIP-2. The activation of mAChR (injection of aceclidine) invoked also increase phagocytic metabolic activity of neutrophils. The realisation of the cholinergic anti-inflammatory pathway (stimulation of peripheric ?7nAChR and central mAChR) is modulated by activation mAChR of cells of macrophage-monocytic system .
Адрес для корреспонденции: pfzabrodsky@gmail.com Забродский П.Ф.
В 1987 году было установлено, что холинергическая стимуляция (подкожное введение мышам необратимого ингибитора холинэстеразы армина в дозах 0,12; 0,25 и 0,5 DL50) существенно снижает летальность белых мышей от сепсиса, вызванного внутрибрюшинным введением E. coli [1]. В дальнейшем была доказана целесообразность использование холиномиметиков (ХМ) для экстренной активации неспецифической антимикробной резистентности организма при различных инфекционных процессах [2]. В 2000 году был описан парасимпатический противовоспалительный путь, в котором основную роль играет блуждающий нерв, активация афферентных волокон которого в результате системных воспалительных реакций на эндотоксин приводит к стимуляции, противовоспалительных реакций [5]. Авторы доказали, что активация эфферентных волокон блуждающего нерва приводит к снижению продукции макрофагами печени провоспалительных цитокинов - ПВЦ (эффект ацетилхолина - АЦХ) [5]. В последние годы в многочисленных исследованиях [3,7,10,12] была подтверждена роль активации холинергической системы в снижении летальности животных при сепсисе [1,2], вызванном различными инфекционными процессами.
Холинергический антивоспалительный путь (механизм) - "cholinergic anti-inflammatory pathway" [9,11,14] включает: м-холинорецепторы (mAChR) головного мозга (вероятно, дорсального вегетативного ядра n. vagus продолговатого мозга), модулирующие иммунорегуляторную функцию блуждаюшего нерва; эфферентные волокна n. vagus; АЦХ; н-холинорецепторы - nAChR - (в частности, ?7nAChR) клеток макрофагально-моноцитарной системы (ММС); система, так называемой, киназы Януса (JAK2); фактор транскрипции STAT3 ("signal transducer and activator of transcription 3"); транскрипцио?нный фактор NF-?B (фактора транскрипции, контролирующий экспрессию генов иммунного ответа, апоптоза и клеточного цикла); ПВЦ (?-фактор некроза опухоли - TNF?, высоко-мобильной группы протеин B1 - HMGB1, макрофагально-воспалительный протеин-2 - MIP-2, интерлейкины ИЛ-1?, ИЛ-6) [6].
Холинергическая стимуляция вызывает активацию ацетилхолином ?7nAChR клеток макрофагально-моноцитарной системы (макрофагов, моноцитов и нейтрофилов), что приводит к снижению летальности от экспериментальной инфекции (в ранней фазе сепсиса) [1,8,12] вследствие снижения продукции клетками ММС и лимфоидными дендритными клетками ПВЦ [9,10,11]. Существуют основания полагать, что такой же эффект способен вызвать м-ХМ, действующий на mAChR ядра n. vagus продолговатого мозга, а также на mAChR ММС [2].
Целью исследования являлась оценка влияния активации mAChR и nAChR соответственно ацеклидином (АК) и никотином (НТ) на летальность мышей от сепсиса, вызванного экспериментальным перитонитом, содержание в плазме крови провоспалительных цитокинов ИЛ-1?, ИЛ-6 и MIP-2 и фагоцитарно-метаболическую активность нейтрофилов.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
Эксперименты проводили на беспородных белых мышах обоего пола массой 18-22 г. М-холиномиметик ацеклидин (АК), проникающий через гемато-энцефалический барьер, и н-ХМ никотин (НТ) вводили подкожно однократно в дозе 0,5 DL50 (DL50 данных препаратов составляли для мышей соответственно 4,12+0,22 и 35?4 мг/кг). Через 6 ч после введения холинергических препаратов у мышей вызывали сепсис внутриперитонеальным введением 2,5·109 суточной культуры микробных тел E. coli [1,15]. Регистрацию летальности мышей проводили без применения ХМ (контрольная группа 1) с применением НК (группа 2) и АК (группа 3) через 10 и 25 ч после моделирования септического процесса. Сроки оценки летальности обусловлены тем, что через 10 ч погибала значительная часть животных, а через 25 ч гибель животных от сепсиса достигала максимума и практически заканчивалась [1,4]. Концентрацию ПВЦ ИЛ1?, ИЛ-6 и MIP-2 исследовали в плазме крови контрольной группы мышей (контрольная группа 2) и мышей, выживших через 10 и 25 ч в и после внутриперитонеального введения E. coli без применения ХМ (контрольная группа 1), с применением НТ (группа 2) и АК (группа 3) методом ферментного иммуносорбентного анализа (ELISA), используя наборы (ELISA Kits). Фагоцитарно-метаболическую активность нейтрофилов (ФМАН) под влиянием АК и НТ (фагоцитарный показатель - ФП, фагоцитарное число - ФЧ, индекс активности нейтрофилов (ИАН) в спонтанном и индуцированном НСТ-тесте) оценивали общепринятыми методами [4]. Кровь для исследований забирали из ретроорбитального венозного синуса. Полученные данные обрабатывали статистически с использованием t-критерия достоверности Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Никотин и АК через 10 ч после введения E. coli приводили к снижению (p<0,05) исследованного летальности по сравнению с контрольной группой 1 (сепсис) соответственно в 2,33 и 1,75 раза ( на 33,3 и 25,0%) (p<0,05), а через 25 ч - в 1,68 и 1,28 раза (на 36,1 и 19,5%) (p<0,05) соответственно. Это свидетельствует о том, что активация как nAChR, так mAChR существенно увеличивает выживаемость животных в ранней фазе сепсиса (табл. 1). При этом эффект НК несущественно превышает действие АК.
Таблица 1. Влияние никотина и ацеклидина на летальность мышей после моделирования сепсиса (М+m, n = 36) (Таблицы можно посмотреть в Приложении)
Содержание цитокинов ИЛ-1?, ИЛ-6 и MIP-2 в плазме крови мышей через 10 ч при сепсисе по сравнению со 2-й контрольной группой мышей (интактные животные) повышалась соответственно в 13,29 и 17,53 и 6,07 раза (p<0,05) (табл. 2). Концентрации ИЛ-1?, ИЛ-6 и MIP-2 в крови мышей после применения НТ с последующим введением E. coli через 10 ч (после моделирования сепсиса) уменьшались по сравнению с показателями при сепсисе (контрольная группа 1) соответственно в 2,49; 1,87 и 2,02 раза (p<0,05). При этом содержание ПВЦ достоверно (p<0,05) превышали контрольные показатели.
Таблица 2. Влияние никотина и ацеклидина на концентрацию провоспалительных цитокинов в крови мышей при сепсисе через 10 и 25 ч, пг/мл (М+m)
Применение АК за 6 ч до моделирования сепсиса приводило через 10 ч после введения E. coli мышам к снижению концентрации в плазме крови ИЛ1?, ИЛ-6 и MIP-2 по сравнению показателями при сепсисе без применения ХМ (контрольной группой 1) соответственно в 1,51; 1,42 (p<0,05) и 1,34 раза (p>0,05) .
Аналогичные, но менее выраженные изменения содержания в крови ПВЦ выявлены при сепсисе без предшествующего применения ХМ (контрольная группа 1) через 25 ч после моделирования сепсиса. Содержание в крови цитокинов ИЛ1?, ИЛ-6 и MIP-2 через 25 ч после моделирования сепсиса во всех сериях опытов существенно снижалось (p<0,05) по сравнению с концентрацией, зарегистрированной через 10 ч после введении E. coli.
Параметры при экспериментальном перитоните с использованием НТ при оценке содержания в крови ПРЦ через 10 и 25 ч были снижены по сравнению с показателями, полученными в экспериментах с применением АК, причем - существенно (p<0,05) при оценке ИЛ1? и MIP-2. При этом содержание ПВЦ статистически значимо (p<0,05) превышало контрольные уровни (контрольная группа 2).
Полученные данные свидетельствуют о том, что не только стимуляция nAChR, но и воздействие на mAChR (вероятно, дорсального вегетативного ядра n. vagus продолговатого мозга) приводит к снижению летальности животных от сепсиса вследствие снижения в крови ПРЦ. Возможно, что снижение летальности обусловлено также активацией mAChR нейтрофилов и других клеток ММС.
Действительно, при воздействии НТ и АК на ФМАН установлено (табл. 3), что АК увеличивает ФП, ФЧ, ИАН в спонтанном и индуцированном НСТ-тесте (p<0,05).
Таблица 3. Изменение фагоцитарно-метаболической активности нейтрофилов в крови мышей и концентрации сывороточного лизоцима после воздействия никотина и ацеклидина (0,5 DL50) через 25 ч (М+m, n = 14)
НТ несущественно (p>0,05) повышал все исследованные показатели, вероятно, вследствие активации nAChR симпатических ганглиев и мозгового вещества надпочечников и последующего действия норадреналина и адреналина на ?-адренорецепторы клеток ММС [4] на фоне супрессирующего эффекта НТ. Это предположение дают основание сделать результаты работы [13], в которой доказано, что активация nAChR и mAChR клеток ММС и лимфоцитов приводит к противоположным эффектам (возбуждение nAChR снижает функцию лейкоцитов, макрофагов и моноцитов). При воздействии АК существенно возрастали ФП, ФЧ, ИАН в спонтанном и индуцированном НСТ-тесте в 1,88; 1,51; 1,82 и 1,64 раза (p<0,05) по сравнению с контролем (контрольной группой 2). Кроме того, активация mAChR АК приводила к увеличению концентрации сывороточного лизоцима у мышей в 1,52 раза (p<0,05).
Выявленные изменения содержания ПВЦ в крови у мышей свидетельствуют о том, холинергический антивоспалительный механизм ("cholinergic anti-inflammatory pathway") [1,2,3,9,11] , приводящий к снижению летальности животных от сепсиса, реализуется не только вследствие активации ?7nAChR моноцитов, макрофагов и нейтрофилов [8], но и в результате воздействия АЦХ на mAChR дорсального вегетативного ядра n. vagus продолговатого мозга. Кроме того, на увеличение выживаемости животных при сепсисе может влиять возбуждение mAChR клеток ММС печени, желудочно-кишечного тракта, селезенки, приводящее к увеличению ФМАН .
Таким образом, воздействие на м- и н-холинергических рецепторы соответственно никотина и ацеклидина (в эквилетальных дозах 0,5 DL50, однократно) за 6 ч до моделирования сепсиса вызывают существенное снижение летальности мышей от экспериментального инфекционного процесса вследствие уменьшения в крови концентрации провоспалительных цитокинов ИЛ-1?, ИЛ-6, MIP-2. Реализация холинергического антивовоспалительного механизма (возбуждение периферических ?7nAChR и центральных mAChR) модулируется активацией mAChR клеток ММС.
ЛИТЕРАТУРА
1. Забродский П.Ф. //Фармакол. и токсикол. 1987. Т 49, N2. С. 57-60.
2. Забродский П.Ф. // Бюл. эксперим. биол. и мед. 1995. Т. 119, N 8. С. 164 - 167.
3. Забродский П.Ф. // Бюл. эксперим. биол. и мед. 2010. Т. 150, N 9. С. 309 - 311.
4. Забродский П.Ф., Мандыч В.Г. Иммунотоксикология ксенобиотиков: Монография. Саратов, 2007. 420 с.
5. Borovikova LV, Ivanova S, Zhang M, et al. // Nature. 2000. Vol. 405, N 6785. P. 458-462.
6. Gallowitsch-Puerta M., Pavlov V. A. Life Sci. 2007. Vol. 80, N24-25. P. 2325-2329.
7. Giebeleh I.A., Leendertse M., Florquin S., van der Poll T. // Eur. Respir. J. 2009. Vol. 33, N2. P. 375-381.
8. Hauber H.P., Zabel P. // Internist. (Berl.). // J. Immunol. 2009. Vol. 50, N7. P. 779-780, 782-784, 786-786.
9. Kessler W., Traeqer T., Westerholt A. et al. // Langenbecks Arch. Surg. 2006. Vol. 391, N2. P. 83-87.
10. Liu C., Shen F.M., Le Y.Y.// Crit. Care Ned. 2009. Vol. 37, N2. P. 778-779.
11. Oke S.L., Tracey K.J. // J. Leukoc. Biol. 2008. Vol. 83, N3. P. 512-517.
12. Pavlov V.A.// Int. J. Clin. Med. 2008. Vol. 1, N3. P. 203-212.
13. Razani-Boroujerdi S., Behl M., Hahn F.F. et al. // J. Neuroimmunol. 2008. Vol. 194, N 1-2. P. 83-8.
14. Rosas-Ballina M., Tracey K.J. // J.Intern. Med.-2009. Vol. 265, N6.P. 663-679.
15. Song D.J., Huanq X.Y., Ren L.C. et al. // Zhonghua Shao Shang Za Zhi. 2009. Vol. 25, N1. P. 36-41
