Владимир Чехонин: Моноклональные антитела к нейроспецифическим белкамНазад
Владимир Чехонин: Моноклональные антитела к нейроспецифическим белкам
СОДЕРЖАНИЕ
Введение
I Общие принципы получения моноклональных антител
(Акад. РАМН Чехонин В.П., д.м.н. Гурина О.И.)
Выбор животных - продуцентов В-лимфоцитов
Выбор миеломных клеток
Антигены и иммунизация
Выбор агентов, сшивающих клетки (агенты слияния)
Среды для культивирования гибридом
Влияние фидерных клеток
Селекция клеток на средах с гипоксантином, аминоптерином и тимидином (HAT-селекция)
Общие принципы скрининга клонов гибридных клеток
Получение моноклональных антител из культуральной жидкости или асцита
Заключение
II Моноклональные антитела к нейроспецифическим белкам
Моноклональные антитела к глиофибриллярному антигену (GFAP) (д.м.н. Гури-на О.И., к.б.н. Шепелева И.И., Павлов К.А., акад. РАМН Чехонин В.П.)
Глиофибриллярный кислый протеин (GFAP)
Моноклональные антитела к GFAP и их клинико-лабораторное применение
Получение и иммунохимический анализ глиофибриллярного кислого протеина. Получение рекопбинантного GFAP.
Получение и иммунохимический анализ моноклональных антител к GFAP
Разработка и стандартизация иммуноферментного анализа GFAP в биологических жидкостях человека и животных
Моноклональные антитела к нейроспецифической енолазе (NSE)
(д.м.н. Гурина О.И., к.б.н. Портная Т.С., Акад. РАМН Чехонин В.П.)
Нейроспецифическая енолаза (NSE) или белок 14-3-2
Моноклональные антитела к NSE и их клинико-лабораторное применение
Получение и иммунохимический анализ нейроспецифической енолазы
Получение и иммунохимический анализ моноклональных антител к NSE
Разработка и стандартизация иммуноферментного анализа NSE в биологических жидкостях человека и животных
Моноклональные антитела к основному белку миелина (MBP)
(д.м.н. Гурина О.И., к.м.н. Семенова А.В., Лохонина А.В., к.б.н. Лазаренко И.П., акад. РАМН Чехонин В.П.)
Основной белок миелина (МВР)
Моноклональные антитела к МВР и их клинико-лабораторное применение
Получение и иммунохимический анализ основного белка миелина
Получение и иммунохимический анализ моноклональных антител к MBP
Разработка и стандартизация иммуноферментного анализа MBP в биологических жидкостях человека и животных
Разработка иммуноферментного анализа антител к GFAP, NSE и MBP в биологических жидкостях человека и животных
Заключение
III Комплексный иммуноферментный анализ нейроспецифических белков и антител к ним в биологических жидкостях с помощью тест-систем на основе моноклональных антител
(д.м.н. Гурина О.И., акад. РАМН Дмитриева Т.Б., к.м.н. Лебедев С.В., к.м.н. Блинов Д.В., д.м.н. Рябухин И.А., Петров С.В., к.м.н. Семенова А.В., к.м.н. Рогаткин С.О., акад. РАМН Володин Н.Н., акад. РАМН Чехонин В.П.)
Cравнительный анализ результатов иммуноферментного скрининга GFAP, NSE и МВР на основе моно- и поликлональных антител в образцах сыворотки крови доноров
Иммуноферментный анализ GFAP и анти-GFAP-антител в биологических жидко-стях больных с заболеваниями, сопровождающимися нарушением проницаемости ГЭБ.
Иммуноферментный анализ NSE и анти-NSE-антител в биологических жидкостях больных с заболеваниями, сопровождающимися нарушением проницаемости ГЭБ
Иммуноферментный анализ MBP и анти-MBP-антител в биологических жидкостях больных с заболеваниями, сопровождающимися нарушением проницаемости ГЭБ
Заключение
IV Моноклональные антитела к нейроспецифическим антигенам в оценке состояния гематоэнцефалического барьера
(Акад. РАМН Чехонин В.П., к.м.н. Лебедев С.В., д.м.н. Гурина О.И., д.м.н. Рябухин И.А., Петров С.В., Волков А.И., к.б.н. Лазаренко И.П.)
Роль НСБ и антител к ним в патогенезе заболеваний и повреждений ЦНС
НСБ - специфические маркёры процесса нейродегенерации
Ликвородинамика и возможные пути проникновения белков из мозга в кровь
НСБ и иммунная система
Оценка возможности проникновения моноклональных анти-НСБ-антител через ге-матоэнцефалический барьер
Заключение
Мониторинг NSE, GFAP, MBP в СМЖ и сыворотке крови крыс при моделировании патологических процессов в ЦНС
Методологические аспекты иммуноферментного анализа НСБ в биологических жидкостях.
Экспериментальное моделирование гипоксического, ишемического и аутоиммун-ного повреждений головного мозга.
Иммуноферментный анализ NSE, GFAP, MBP в СМЖ и сыворотке крови при моде-лированных поражениях ЦНС
Оценка патогенетической значимости НСБ в биологических жидкостях.
Заключение
Исследование проницаемости ГЭБ для моноклональных антител к GFAP и NSE при экспериментальном ишемическом инсульте у крыс
V Моноклональные антитела к нейроспецифическим антигенам как векторы при транспортировке микроконтейнерных систем к клеткам-мишеням нервной ткани.
(Акад. РАМН Чехонин В.П., к.х.н. Жирков Ю.А., д.м.н. Гурина О.И., акад. РАМН Дмитриева Т.Б., к.м.н. Лебедев С.В., к.х.н. Кашпаров И.А. , к.м.н. Семенова А.В., к.б.н. Андреева Н.А., Рябинина А.Е., Максимова М.А., Буланов К.А., Цибулькина Е.А., Савченко Е.А.)
Основные аспекты
Состав, структура и образование липосом
Физические свойства липосом
Стерически стабилизированные, или stealth-липосомы направленного действия
Исследование взаимодействия препарата ПЭГилированных иммунолипосом с аст-роцитами, шванновскими клетками и olfactory ensheathing cells в условиях in vitro.
Заключение
VI Моноклональные антитела к нейроспецифическим белкам в радиоиммунодиагно-стике и терапии низкодифференци?рованных глиом.
(Акад. РАМН Чехонин В.П., к.м.н. Баклаушев В.П., Юсубалиева Г.М., Павлов К..А.., Ухова О.В., к.м.н. Семенова А.В., д.м.н. Гурина О.И., к.х.н. Скоблов Ю.С., д.м.н., проф. Белопасов В.В.)
Прямая конъюгация антител с радиоактивным изотопом
Многокомпонентные системы для радиоиммунной диагностики и терапии
Радиоиммунодиагностика
Радиоиммунотерапия
Радиоиммунолокализация глиобластомы С6 с помощью антител к GFAP и эндоте-лиальному антигену AMVB1.
Направленный транспорт моноклональных антител, меченных иодом-125, в область экспериментальной глиомы С6 in vivo
Заключение
Приложение. Методы иммунохимической нейробиологии.
Bведение
Биосинтез антител является интегральной частью индивидуальной иммунной реакции на антиген, вторгающийся в организм. Молекулярная структура антител обеспечивает двойственность их функций: с одной стороны, она обеспечивают специфичность к соответствующим антигенам, а с другой - определяет различные эффекторные функции, направленные на деструкцию специфической патогенетической цели. Вследствие этого антитела являются определяющими молекулами в организации иммунной защиты организма, а биологические свойства обуславливают их применение в клинико-лабораторных исследованиях и, что особенно важно, - при терапии некоторых заболеваний.
Внедряющиеся патогены нередко представляют собой хорошо сбалансированные организмы, несущие на поверхности множество различных антигенных детерминант (эпитопов). Поэтому очевидным общебиологическим преимуществом для организма является продуцирование широкого спектра антител, гарантирующих, что любой патоген будет эффективно обнаружен и уничтожен.
С другой стороны, свойство высокоспецифично реагировать с антигеном открывает широкие перспективы их применения для идентификации биологически активных веществ, а часто и отдельных эпитопов на одной молекуле, являясь инструментами не только для однократного детектирования и идентификации антигенов в биологических жидкостях, но и для их динамического мониторинга и контроля эффективности проводимой терапии.
Иммунный ответ формируется как результат распознавания инородного материала соответствующими лимфоцитами, специфичными к антигенам. При этом активация В-лимфоцитов приводит к продукции антител, а активация Т лимфоцитов - к деструкции инфицированных клеток. Лимфоциты распознают антиген посредством специфических рецепторов своей клеточной поверхности. Для В-клеток эти рецепторы состоят из молекул антител, связанных с клеточными мембранами.
Каждая клетка несет на своей поверхности приблизительно 50 000 рецепторных молекул. Но поскольку отдельные типы рецепторов обладают индивидуальной специфичностью, каждая отдельная В-клетка имеет ограниченную специфичность. Но индивидуум как целое располагает многими миллионами различных В-клеток, формирующих его иммунный спектр. Поэтому проникновение экзогенного антигена в такой организм активирует те В клетки, которые несут на своей поверхности рецептор к этому антигену.
Такая активация приводит к двум основным событиям. Во-первых, В клетки подвергаются нескольким митотическим делениям, пролиферируя только те клоны, которые имеют на своей поверхности соответствующий рецептор. Во-вторых, эти дочерние клетки дифференцируются в другие плазматические клетки или В клетки памяти. Функция плазматических клеток состоит в секретировании большого количества антител только той специфичности, которая соответствует рецепторам на поверхности первоначально активированных В клеток. Функция клеток памяти заключается в организации повышенного иммунного ответа на соответствующий представленный антиген. Более того, антитела, синтезированные во время вторичного иммунного ответа, обладают более высокой аффинностью - вследствие эволюции В клеток памяти, вовлекающихся в процесс гипермутации в гене, несущем информацию о структуре рецептора, путем антигенной селекции (созревание аффинности).
Известно, что молекулы антител представляют собой гликопротеины, состоящие из двух одинаковых тяжелых и двух одинаковых легких полипептидных цепей. В тяжелых цепях выделяют четыре или пять отдельных структурных доменов. Четыре таких домена имеется у тяжелых цепей антител, относимых к иммуноглобулинам классов IgA, IgG и IgD, пять - у тяжелых цепей IgM и IgE). В легких цепях выделяют по два домена. Способность антител связывать антигены определяется их N концевыми доменами. Каждый сайт связывания антигена формируется комбинацией таких терминальных доменов тяжелой и легкой цепей. Остальные домены определяют эффекторные функции антител (запуская каскад комплемента или активируя фагоцитоз посредством связывания с Fc-рецепторами на макрофагах).
Специфичность антител определяется первичной структурой N концевых доменов, различной у различных молекул иммуноглобулинов. Поэтому их называют вариабельными доменами (v-доменами). Остальные домены менее изменчивы и поэтому обозначаются как константные с-домены. Поскольку, как уже отмечалось для простейшего случая, каждая молекула антител состоит из парных тяжелых и легких цепей, она содержит и по два абсолютно идентичных сайта связывания антигена.
Однако в v-домене вариабельна не вся его структура, а лишь три участка (так называемые гипервариабельные участки), которые и определяют структурную комплементарность между сайтом связывания и пространственным строением связываемого участка антигена. Эти гипервариабельные участки образованы изгибами экспонированных ? складчатых поверхностей. Изменения аминокислотных последовательностей этих участков меняют и пространственную конфигурацию сайта связывания. Вследствие этого, первичные структуры гипервариабельных участков определяют и физико-химическую природу связей между антителом и антигеном (а также их "силу"), которые проявляются как специфичность и аффинность антитела. Весьма важно, что точечные мутации в генах v-доменов, происходящие при эволюции В клеточной памяти, могут генерировать пулы антител с повышенной аффинностью.
Каким же образом бифункциональные белки антител кодируются в геноме? Первоначально предполагалось, что каждый такой белок (специфичный к отдельному антигену) кодируется своим индивидуальным геном. Но, учитывая колоссальное разнообразие отдельных антител, специфичных к невообразимому множеству различных антигенов, полная совокупность кодирующих генов должна была бы занимать едва ли не полный геном индивида. В последствии выяснилось, что молекулярно-биологические механизмы формирования большого разнообразия молекул антител обеспечиваются гораздо меньшим количеством генетических элементов. Это связано с тем, что каждая полипептидная цепь антитела кодируется отдельным генным локусом (как например ?-, ?-, ?- и ?-локусы изотипов тяжелых цепей или ?- и ?-локусы изотипов легких цепей). При этом в каждом локусе имеются экзоны, которые кодируют константные домены соответствующих цепей (эти домены и определяют изотипы иммуноглобулинов). Кроме того, каждый локус имеет дополнительные кластеры (или семейства) экзонов, которые используются В клетками для составления их собственных уникальных генов, кодирующих вариабельные области. Комбинаторика этих элементов (при их молекулярно-биологической вариабельности) позволяет создавать то самое разнообразие структур вариабельных участков, которое характерно для всей совокупности существующих и возможных молекул антител (порядка 1010 вариантов, обеспечиваемых многократно меньшим количеством исходных геномных единиц). Например, с локусом IgH ассоциированы три генных семейства - V, D и G, а с локусами ? и ? только два (V и D). При дифференцировке каждая В клетка "как бы случайно" выбирает по одному V- и G экзону для легкой цепи и по одному V-, G- и D экзону для тяжелой, формируя при этом уникальный изменяющийся участок гена для обеих цепей и тем самым определяя свою собственную уникальную специфичность, избираемую из множества 1010 вариантов. При этом самое удивительное то, что фактически рецепторный спектр В клеток формируется как бы случайно.
Очевидно, что в результате действия такого механизма образуется множество В клеток с различной специфичностью, и это разнообразие отражается в секретируемых антителах, продуцируемых после клональной экспансии и дифференцировки антиген-активированных клеток. Совокупный пул этих антител является, естественно, поликлональным, что является крайне благоприятным, выгодным и полезным для распознавания и уничтожения внедрившегося антигена. Однако, в аналитической практике поликлональные антитела не в полной мере обеспечивают чистоту определения антигенов . Поэтому в подавляющем большинстве ситуаций, характерных для иммунохимического анализа, предпочтительнее иметь более однородные препараты антител с единой специфичностью и аффинностью, что как раз и характерно для популяции антител, продуцируемых одним клоном В клеток, т.е. для моноклональных антител.
Очевидно, что практически невозможно непосредственно выделить индивидуальные клоны из их пула, уже сложившегося в конкретном организме. Но можно попытаться произвести их в особых условиях in vitro, комбинируя методы клеточного слияния, селекции и клонирования. И такая попытка удалась Г. Кёлеру и С. Мильштейну. Они разработали гибридомную технологию получения моноклональных антител, за которую в 1984 году были удостоены Нобелевской премии по физиологии и медицине. Это прекрасный пример того, как фундаментальные академические исследования могут привести к решению широчайших прикладных проблем современной науки, технологии и клинической медицины.
